Western blotting 원리 / western blot 원리 / western blot / 웨스턴블롯 원리 / 웨스턴블롯팅 원리 / SDS-PAGE 원리

Western blot은 특정 단백질을 검출하기 위해서

사용하는 실험 방법이다.

1. Sample preparing and loading
2. SDS-PAGE
3. Transfer to membrane
4. Primary antibody and washing
5. Secondary antibody and washing
6. Detection

1. Western blotting 원리

Western blot은 세포나 조직에서 얻은 단백질들에서 특정 단백질 (specific protein)을 검출할 수 있는 실험 방법이다. 기본 원리는 단백질을 size별로 분류한 뒤에 발현 양을 확인하고 싶은 항체를 이용하여 확인 하는 것이다. 즉, 항원-항체 반응을 이용한 단백질의 발현을 확인할 수 있는 실험 방법이다. 그렇다면 각 workflow 별로 좀 더 자세히 알아보도록 하겠다.

전기영동에 영향을 주는 요인들은 세 가지가 있다.

1. 단백질의 크기 즉, size이다. 단백질의 크기가 클수록 polyacrylamide gel을 통과하는 속도가 늦어지게 되고 위쪽에 남게 된다.
2. 단백질이 갖는 전하 (charge)가 영향을 준다. 전기 영동은 말 그대로 전기로 물질을 움직이게 하는 것이기 때문에 단백질 자체가 전하를 띄게 되면 전기 영동되는 속도가 달라진다.
3. 단백질의 구조 또한 전기 영동에 영향을 준다. 사이즈는 같으나 작게 뭉쳐져 있는 단백질 A와 크게 퍼져 있는 단백질 B가 있다. 당연히 작게 뭉쳐져 있는 단백질A가 크게 퍼져있는 단백질 B보다 훨씬 잘 움직일 수 있다.

Western blot의 목적은 size별로 단백질을 분류하고 western blotting 원리인 항원 항체 반응을 이용하여 target 단백질을 검출하는 것이 목적이다. 다시 말하면, 단백질의 전하와 구조라는 변수는 제거 해야 한다는 것이다. 그 방법에 대해서 알아보자.

1) 단백질의 전하 – Western blot에서 SDS의 역할

Western blotting 원리는 항원 항체 반응이지만 아무렇게나 항체를 반응 시키는 것이 아니다. Western blotting 수행하기 위해서 sample을 준비하는 과정을 거쳐야 한다. 이 step에서 굉장히 중요한 역할을 하는 것이 sodium dodecyl sulfate (SDS) 이다. SDS는 detergent로 세포막을 녹여 단백질이 밖으로 나올수 있게 할 뿐만 아니라 단백질을 coating하여 negative charge로 바꾸어 준다. 위에서 말했듯이 전하는 전기영동의 속도에 영향을 줄 수 있다. 하지만, SDS가 모두 음전하로 바꾸어 주었기 때문에 전하라는 변수를 없에고 오직 size로만 분류가 가능하게 하는 것이다.

2) 단백질의 구조 – Western blot β-mercaptoethanol의 역할

이외에도 고려해야 할 것이 바로 단백질의 구조이다. 단백질은 2차 구조, 3차 구조를 형성하고 있어서 사이즈가 같다고 하더라고 어떠한 형태를 띄고 있는가에 따라서 전기 영동에서 다르게 분류될 수 있다. 위에서도 말했듯이 단백질의 size는 같으나 작게 뭉쳐져 있는 단백질과 넓게 퍼져있는 단백질은 전기 영동 할 때 전기에 의해 움직이는 속도가 달라지게 된다. 그래서 모두 같은 구조로 만들어주기 위해서 linear 형태로 만들어주게 된다. linear 구조로 만드는 것이 β-mercaptoethanol이다. β-mercaptoethanol은 이황화 결합 (disulfide bond)를 끊어 주어 단백질이 형성하고 있는 구조를 linear 형태로 바꾸는 역할을 한다.

2. Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Sampling 과정을 거쳐서 준비된 단백질 시료를 SDS-PAGE gel에 loading 하고 전기를 걸어주어 size별로 분류하는 과정이다. polyacrylamide gel이 단백질을 size별로 분류하기 좋은 이유는 다음과 같다.

1. 전기적으로 중성이다.
2. 친수성이다.
3. SDS-PAGE에 사용되는 buffer와 반응하지 않는다.
4. 단백질과 결합력이 매우 낮다.

정리하자면 단백질을 size만을 고려하여 분류할 수 있는 gel이라고 생각하면 된다.

3. Polyacrylamide gel (PAGE)

Polyacrylamide gel은 bis-acrylamdie에 ammonium persulfate (APS)와 tetramethylethylenediamine (TEMED)를 넣어주면 polymerization 시작되며, 이 속도는 온도와 농도에 따라 다르다. Western blot에서는 주로 8~15%의 gel이 사용되는데 % 농도가 높을수록 작은 size의 단백질을 분류하는데 유리하며 반대로 % 농도가 낮을 수록 큰 단백질을 분리하는데 용이하다. .

(출처: https://info.gbiosciences.com/blog/bid/203026/pvdf-or-nitrocellulose-which-membrane-is-best)

Stacking gel 원리 & Separating gel 원리

Stacking gel은 loading 된 sample들을 한 줄로 정렬하게 만드는 gel이다. 즉, 출발선을 맞추어 준다고 생각하면 된다. 보통 4%의 낮은 농도로 만들게 되며 pH가 6.8로 sperating gel (pH8.8) 에 비해 낮다. 이 pH가 단백질을 정렬하게 만드는 결정적인 요인이다. pH가 6.8에서는 각 물질들의 이동 속도가 다음과 같다.

Cl^– > protein > Glycine (PI=6.2)

즉, 단백질의 이동 속도가 염소 이온과 glycine 사이에 위치하게 되므로 단백질들이 일직선으로 정렬되게 된다. 하지만, 이 물질들이 pH가 8.8인 saperating gel에 도달하게 되면 이동 속도가 다음과 같이 변화된다.

Cl^– > Glycine(PI=6.2) > Protein

그러므로, sperating gel에서는 단백질의 size별로 분류가 가능하게 된다.

4. Transfer (Membrane) 원리

이렇게 분류가 된 단백질들은 blotting membrane으로 transfer 시켜준다.  Polyvinylidene difluoride (PVDF) 와 nitrocellulose (NC) membrane이 주로 사용된다. 각 membrane 별 특성은 아래의 표와 같다.

PVDF membrane에 단백질들이 더 잘 달라붙을 수 있으므로 적은 양의 단백질을 검출하기에는 PVDF membrane이 더 좋다. 하지만 그만큼 민감도가 높기 때문에 background가 지저분하다. NC membrane은 반대라고 생각하면 된다. 단백질들이 달라붙는 능력은 좀 떨어지더라도 background가 깨끗하다는 장점이 있다.

Membrane의 pore size도 고려 해야 하는데 보통 0.1, 0.2 or 0.45μm이 쓰인다. 0.45μm를 일반적을 사용하며 15KD까지는 사용해도 무방하다. 하지만 그 보다 작은 사이즈의 단백질을 detection하고자 한다면 pore size를 더 작은 것을 사용 하는 것이 좋다.

5. Western blot blocking 원리

Blocking은 non-specific binding 즉, 비 특이적인 결합을 줄이기 위해서 수행하는 step이다. Blocking에는 주로 BSA나 Skim milk가 주로 사용되며 이는 membrane의 빈 공간 등을 blocking 함으로써 비 특이적인 반응을 줄여 원하는 target에 항체가 더 잘 붙게 하는 효과가 있다.

6. Detection 원리

단백질을 이 membrane들로 transfer해 준 뒤에 검출하고자 하는 단백질의 primary antibody를 붙여준다. 그 후에 비 특이적인 반응을 제거하기 위해서 wahsing을 해준 뒤 secondary antibody를 붙여준다. Secondary antibody에는 Horseradish Peroxidas (HRP)가 붙어있기 때문에 substrate로 넣어주었을 때 빛을 발산하게 되고 이를 film이나 기계로 detection 할 수 있다.

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Western blot buffer

Western blot protocol