Western Blot Protocol / Western Blotting Protocol / Western Blot 프로토콜/ 웨스턴블롯 프로토콜
By Western blot protocol은 크게 Sample preparation, Gel running, Transfer, Blocking, Antibody incubation, Detection이렇게 6가지로 구성되어 있다. 각각 step별로 실험방법과 주의사항을 알아보겠다.
1. Sample Preparation
- Culture dish에서 Cell harvest하여 EP tube로 옮긴 후 PBS를 이용하여 washing 하여 cell pellet을 얻는다.
- Cell pellet을 RIPA buffer로 lysis 한다. Buffer의 양은 cell의 양과 종류에 따라 다르지만 대략 1 X 106 개의 cell에 약 100µl의 lysis buffer를 넣는다. pipet을 이용하여 잘 섞어준 뒤 가볍게 voltexing하여 Ice에서 15~30min 가량 incubation 시킨다.
- 원심 분리하여 cell debris를 가라앉힌다. (14,000 rpm (16,000xg), 15 min, 4°C)
- 상층액만 새 튜브로 옮긴다.
- Sample buffer와 잘 섞은 뒤 5min 정도 끓는 물에 중탕 또는 heat block을 이용하여 가열한다. ice 에서 5분 간 식힌 뒤 spin down 하여 액화되어 표면에 맺힌 액체들을 모아준다.
2. SDS-PAGE (gel running)
- Sample이 준비되는 동안 gel을 pre-running 해준다 (10 min).
- pre-running한 gel 에 sample을 loading 한다. Gel을 직접 만들어 stacking gel이 있는 경우에는 100 V 로 stacking gel 까지 내려준 후 200V로 올려 sperating gel에서 샘플을 running한다 (Gel을 구매하여 사용하는 경우 제조사의 instruction을 따르면 된다.)
- 확인하고자 하는 단백질의 크기에 따라서 gel의 %를 결정한다. 절대적인 것은 아니나 다음을 참고하면 된다. (4-5% gel, > 200 kD; 7.5% gel, 120-200 kD; 8-10% gel, 40-120 kD; 13% gel, 15-40 kD; 15% gel, < 20 kD)
3. Transfer
Transfer는 어떤 제조사의 제품을 사용 하느냐에 따라서 카세트의 조립 방법이 다르다. 하지만 공통적인 것은 전류는 (-) 에서 (+) 로 흐르며, sampling이 끝난 단백질은 SDS에 의해 coating되어 음전하를 띄고 있다. 즉 (-)에서 (+) 방향으로 이동하게 되어 있다. 그러므로, (-) 쪽에 Gel이 (+)에 membrane이 있으면 된다. Transfer time 역시 어느 제조사의 transfer tank를 사용 하는지에 따라서 그 시간과 조건이 다르다. 제조사의 instruction을 따르는 것을 추천한다. 다만 transfer에서는 열이 많이 발생하므로 cold room이나 tank를 ice안에 넣고 하는 것을 추천한다. Transfer buffer 역시 미리 차갑게 하여 사용하는 것이 좋다.
많이 사용하는 transfer module maunal
4. Membrane Blocking
3~5%의 BSA나 skim milk를 사용한다. TBST에 녹여 사용하면 된다. Membrane이 잠길 정도면 충분하며 상온에서 1 h 정도 aggitation 하며 blocking한다.
5. Primary Antibody Incubation
Antibody의 dilution은 어떤 antibody를 사용 하느냐에 따라서 다르다. 제조사의 instruction을 따르는 것을 추천한다. 하지만 antibody의 경우 워낙 고가이므로 좀 더 dilution하여 사용하기도 한다. Skim milk를 TBST에 녹인 buffer에 antibody를 dilution하여 사용하는 것이 좋다. 만약 재 사용을 할 계획이 있다면 skim milk는 사용하지 않는 것이 좋으며 sodium azide를 추가하여 사용하는 것이 좋다. 다만 sodium azide를 추가하는 경우 antibody의 활성이 감소하는 경우도 있으므로 주의한다. 4°C 에서 aggitation 하면서 overnight으로 반응시킨다.
6. Washing & Secondary antibody incubation
- 10분씩 3~5회정도 TBST로 washing한다.
- Washing이 끝난 뒤 secondary antibody를 dilution 하여 상온에서 1 ~ 2 h 정도 반응시킨다.
- 반응이 끝난 뒤 TBST로 10 분씩 3~5회 정도 washing 한 후 detection 한다.