Immunoprecipitation (IP) 프로토콜 / IP 프로토콜 / Imunopreciptiation protocol / IP protocol
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IP assay는 단백질을 다루는 실험이므로 모든 step에서 온도를 낮게 유지하는 것이 좋다. 왜냐하면 단백질은 고온에서 3차 구조가 변성되기 때문에 단백질의 결합에 영향을 줄 수 있기 때문이다.
Immunoprecipitation protocol
- Preparing the lysates
- Pre-clearing the lysates (optional)
- Immunoprecipitation
- Binding A/G agarose bead
- Washing
- Western blot
1. Lysate의 준비 (Preparing the lysates)
Cell harvest
- Media를 제거하고 cold PBS를 넣은 뒤 cell culture dish에서 cell을 scraper로 잘 긁어 모은다.
- Cold PBS로 1~2회 washing한다.
- Washing 후 상층액을 제거하고 pellet 형태로 ice에 둔다.
Cell lysis
- Lysis buffer를 넣어준 후 pipet을 이용하여 잘 섞어준다.
- 가볍게 2 ~3 sec vortexing한 후 4 ℃ 에서 30 min 정도 agitation 한다.
- Centrifuge 하여 cell debris 와 상층액을 분리한다. (12000 RPM, 15 ~ 20 min)
- 상층액만 잘 덜어내어 새 튜브로 옮긴다.
2. Pre-clearing the lysates (optional)
Pre-clearing은 문자 그대로 “pre” 사전에 “clearing” 깨끗하게 하는 것이다. 이는 bead와 binding하는 protein을 제거하는 step이다. 사전에 lysate에 사용할 antibody와 같은 타입의 normal IgG와 bead를 반응시켜 non-sepcific한 binding을 줄여주는 것이다. 이 step은 optional이다. 왜냐하면 non-specific이 나오지 않는 실험에서는 의미가 없으며 yield를 떨어뜨릴 수 있기 때문에 non-specific 결합이 많을 때 사용하면 좋다.
- 사용할 antibody와 같은 type의 antibody와 사용할 bead를 넣어주고 4 ℃ 에서 1h 정도 agitation 하여 반응시킨다. (ex normal mouse/rabbit IgG, normal serum도 사용 가능하다)
- 원심 분리하여 bead와 상층액을 분리한다.
- 상층액만 새 튜브로 옮겨서 immunoprecipitation을 준비한다.
3. Immunoprecipitation
Immunopreciptiation하는 방법에는 크게 두가지가 있다. 단백질과 antibody를 먼저 붙이고 나중에 bead를 붙이는 방법과 antibody와 bead를 먼저 붙이고 단백질과 반응시키는 방법이 있다. 어느 방법을 사용해도 상관 없다.
Protein + Antibody / bead
- 1 ~ 2 ug의 lysate와 recommend 하는 antibody를 섞어 준 뒤 4 ℃ 에서 overnight으로 반응시킨다.
- 반응이 끝난 뒤 A/G agrose bead를 넣어 4 ℃에서 1~2 h 반응 시켜준다 (사용하는 bead에 따라 다름)
Antibody + bead / protein
- Antibody와 bead를 반응 buffer 에서 1 ~ 2 h 먼저 반응 시킨다.
- 반응이 끝난 뒤, 원심 분리하여 상층액을 제거한다.
- 1 ~ 2 ug의 lysate와 antibody/bead 복합체를 반응 시켜준다.
4. Washing
- 반응이 끝난 sample을 원심 분리하여 상층액을 제거한다.
- 반응에 사용한 IP buffer 혹은 washing buffer를 사용하여 4 ℃ 에서 5~10 min 씩 2~3회 정도 washing 한다.
5. Western blot
Washing이 끝난 sample은 bead 와 붙어있는 antibody 그리고 그 antibody를 target으로 하는 단백질과 결합되어 있을 것이고, 이 target 단백질과 결합하고 있는 여러 complex들이 함께 있을 것이다. 그러므로, 그 단백질 복합체들을 western blot을 통해서 size별로 분류하고 antibody를 이용하여 확인하면 된다.