Western blot buffer 역할/ western blotting buffer 역할/ 웨스턴블롯 buffer 역할 / 웨스턴블롯 버퍼 역할

On 8월 9, 2020

Western blot buffer에 대해서 알아보도록 하겠다. 필요한 buffer들의 종류에는 lysis buffer, sample loading buffer, running buffer, transfer buffer, blocking buffer, washing buffer 등이 있다.

1. Lysis buffer – RIPA buffer (radioimmunoprecipitation assay buffer)

RIPA buffer는 ionic detergent인 sodium deoxycholate (SDC)가 포함되어 있고 일반적으로 western blot에서 많이 사용되는 buffer이다. 강한 detergent인 SDS와 SDC가 포함되어 있어 핵까지도 모두 lysis할 수 있다. 적은 background를 갖는다는 장점이 있지만 kinase나 protein-protein interaction 등을 방해할 수 있어서 IP나 pull-down assay에서는 잘 사용되지 않는다.

– RIPA buffer 조성 (농도는 working 농도)

50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
150 mM NaCl
1% IGEPAL CA-630 or NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
1X Protease inhibitor cocktail

2. Loading, running, transfer, and blocking buffers

1) Sample loading buffer

이 buffer의 조성은 딱 정해져 있는 것은 아니다. Sample loading buffer의 조성은 매우 다양하며 lab마다 조금씩 다르다. 하지만 핵심적인 역할을 하는 buffer는 모두 공통적으로 들어있으며 그 농도만 조금씩 다르다. 이 Sample buffer는 sampling 과정에서 가해지는 고온의 열로부터 protein을 보호할 뿐만 아니라 pH의 변화도 최소화 하는 역할을 수행한다. 또한, β-mercaptoethanol의 역할은 이황화결합 (disulfide bond)를 끊어 주어 모든 단백질을 linear form으로 바꾸어준다. SDS 역할 역시 단백질의 linear form에 관여하며 단백질의 charge를 netagive charge로 바꾸어 주는 역할을 수행한다. Glycerol의 역할은 sample의 밀도를 증가시켜 아래로 가라앉게 만드는 역할을 수행하며 이외에도 단백질 안정화에 작용한다.

– Sample buffer 조성

250 mM TrisHCl (pH6.8) – 완충효과
10% SDS – 단백질의 negative charge, linear form 유지
30% Glycerol – sample의 밀도증가, 단백질 안정화
5% β-mercapitalethanol (or 0.5M DTT) – Disulfide bond 제거, linear form에 관여
0.02% bromophenol blue – Sample 위치 확인

2) SDS running buffer (Tris-Glysine)

SDS runnng buffer는 전기영동간에 protein을 linear form으로 유지시켜 size별로 분류시킬 수 있도록 환경을 조성해주는 buffer이다.

– 1X SDS running buffer 조성 (보통 10X로 만들어 보관)

25 mM Tris base
190 mM glycine
0.1% SDS
Check the pH and adjust to 8.3

3) Transfer buffer (wet)

Transfer buffer는 transfer 중에 membrane에 protein이 잘 흡착되도록 환경을 조성해주는 buffer이다. Methanol이나 isopropanol을 넣어주는 이유는 SDS를 제거하여 membrane에 protein이 잘 흡착되게 하기 위함이다.

– 1X transfer buffer 조성 (10X로 만들어 보관, methanol or isopropanol은 사용 직전에 넣어줌)

25 mM Tris base
190 mM glycine
Adjust pH 8.3
10% methanol or isopropanol

4) Blocking buffer

Membrane의 빈 공간을 blocking하여 non-specific binding을 줄여주는 buffer이다.

3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)
Dissolve in TBST buffer

3. Washing buffer

10x TBS buffer 조성 (Tris-buffered saline)

보통 10X로 만들어 보관한다 (1X 사용시 D.W 900ml + 10X TBS 100 ml).

1500 mM NaCl
500 mM Tris-HCl
Adjust pH 7.6

1X TBST buffer 조성 (1L 기준)

10X TBS: 100ml
Tween-20: 1ml
Distilled water: 899ml

4. Stripping buffer

Membrane에 antibody를 붙이고 detection을 한 뒤 다른 antibody를 붙이고 싶을때 사용하는 buffer이다. Membrane에 붙은 antibody들을 제거하는데 사용된다. 사용 후에는 TBST로 충분히 wahsing을 해야 다음 antibody가 붙는데 지장이 없다.

Stripping buffer 조성 (100ml 기준)

10% SDS: 20 mL
0.5 M Tris HCl (pH 6.8): 12.5 mL
Distilled water: 67.5 mL
Add 0.8 mL β-mercaptoethanol under the fume hood