Transcription activator-like effector nucleases (Talen) 원리 / Talen 원리 / Genome editing 실험
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Talen은 genome editing의 한 종류로
Tal effector를 이용하여 DNA 서열을 인지하고
Fork I endonucleas를 이용하여 DNA를 절단한다
1. Genome editing의 기본 원리
유전자 편집의 (Genome editing) 기본 원리는 거의 동일하다.특정 부위를 인지하는 domain과 DNA를 절단하는 domain 크게 두 가지로 나뉘어져 있으며, 이것을 어떠한 것으로 사용 하는 가에 따라서 그 실험 방법이 달라진다고 생각하면 된다.Genome editing DNA 서열인지 Endonuclease Zinc-figner nuclease (ZFN) Zinc-finger domain
(Zinc-finger domain 1개당 3개의 nucleotide)Fork I Transcription activator-like effector nucleases (Talen) Tal effector
(a.a 2개당 1개의 nucleotide)Fork I CRISPR / Cas9 system guid RNA (gRNA)
(1개의 nucleotide 당 1개의 nucleotide – 20 bp)Cas9 protein
2. Transcription activator-like effector nucleases (Talen) 원리
Transcription activator-like effector nucleases (Talen) 원리는 앞서 포스팅한 ZFN의 원리와 거의 동일하다. 심지어 사용한 nucleases까지 동일 (Fork I) 하다. 다만 DNA를 인지하는 domain이 zinc finger domain이 아닌 Transcription activator-like effector (Tal effector) 인 것이다.
독일의 Martin-Luther-University Halle-Wittenberg 와 미국의 Iowa State University 에서 TAL effector라는 nucleotide를 인지하는 code를 발표했다. 이는 식물에 감염되는 박테리아인 Xanthomonas에서 추출한 것이다. 이 TAL domain은 33~35개의 아미노산으로 구성되어 있으며 두개의 아미노산이 하나의 nucleotide를 인지할 수 있다. (HD = C; NG = T; NI = A; NS = A, C, G, or T; NN = A or G; and IG = T)
이 두 개의 아미노산을 Repeat Variable Diresidue (RVD)라 한다. 즉, DNA를 인지하는 부분이 zinc finger domain이 아니고 RVD으로 바뀌었으며 기본적인 원리는 ZFN과 동일하다.
다시 한 번 설명하자면 TALE (Transcription activator-like effector)에 Fork I 이라는 endonuclease를 fusion 시켜 이용한다. Fork I endonuclease는 type 2 endonuclease로 이합체를 (dimer) 이루어야 작용할 수 있는 endonuclease이다. 양쪽의 상보적인 seqeunce가 모두 일치하여 ForK I이 dimer를 이루었을 때만 DNA를 절단할 수 있도록 구상한 것이다. DNA가 절단 된 후에 교체하고 싶은 DNA 조각을 넣어 ligation 시켜 특정 유전자 서열을 insertion 하거나 NHEJ pathway를 통한 mutation이 생기게 된다. 이때 발생하는 frame shift에 의해서 발생하는 stop codon을 이용하여 유전자의 knock out을 유도할 수 있다.