Stripping buffer 원리 / western blot stripping buffer 원리

On 9월 29, 2020

Stripping 의 목적은 이미 결합된 항체를 제거하고
다른 항체를 결합시킨 결과를 얻기 위함이다.

1. Stripping 이란?

Western blot stripping은 membrane에 붙였던 항체를 제거하고 다른 항체를 붙이는 것을 뜻한다. 영어 단어 strip (옷을 벗기다) 의 뜻처럼 이미 결합되어 있는 항체를 벗겨내고 새로운 항체를 붙이는 것을 뜻한다. Stripping 원리는 항체가 제대로 작용하지 못하게 하여 제거하는 것이다.

2. Stripping buffer 종류

Western blot stripping 방법에는 크게 두 가지가 있다.

Mild stripping
Harsh stripping

물론 회사에서 판매하는 commercial buffer를 사서 구매하는 것도 좋다. 구매해서 사용하는 것들은 각자 회사만의 방법으로 manual 하게 하는 것보다 간편하고 효과도 좋은 편이다. 하지만 가격이 비싼 단점이 있으니 만들어서 사용하는 법을 알아보도록 하자.

3. Mild stripping buffer recipe

Mild stripping buffer는 낮은 pH의 glycine buffer로 stripping 하는 방법이다. 조성은 다음과 같다 (1L 기준).

1.5 % Glycine (1L 기준 – 15 g)
1 % Tween-20 (1L 기준 – 10 ml)
0.1 ~ 1 % SDS (1L 기준 – 1 g ~ 10 g) -Optional
D.W 800 ml
HCl을 이용하여 pH를 2.2로 맞춘다.
D.W를 추가하여 1L 로 맞춘다.

4. Mild stripping buffer protocol

Memrane이 잠길 정도로 buffer를 넣고 상온에서 5~10분 정도 aggitation 하며 반응 시킨다.
기존의 Buffer를 버리고 새 buffer를 추가하여 5~10 분 다시 반응시킨다.
Buffer를 제거한 뒤 PBS로 10 분동안 washing 한다. (두번 반복)
TBST를 이용하여 5 분동안 washing 한다. (두번 반복)
다시 blocking 한 후 항체를 반응시킨다.

5. Mild Stripping buffer 원리

낮은 pH의 glycine 용액은 항체를 구조적으로 변화시켜 더 이상 결합할 수 없게 만들고 이를 이용하여 항체를 제거 할 수 있다.

이 방법은 mild한 방법이므로 항체가 잘 제거 되지 않을 시에는 SDS를 추가하여 사용해 볼 수 있다. 하지만 결합이 강한 항체의 경우에는 잘 제거되지 않으므로 harsh한 방법을 사용하도록 한다.

6. Harsh stripping buffer recipe (100ml 기준)

Harsh stripping buffer는 SDS와 ß-mercaptoethanol로 고온에서 stripping 하는 방법이다. 조성은 다음과 같다 (100 ml 기준).

10 % SDS – 20ml
Tris HCl, pH 6.8, 0.5 M – 12.5 ml
D.W – 67.5 ml
800 ul ß-mercaptoethanol (hood 에서 작업)

7. Harsh stripping buffer protocol

Buffer를 50°C로 데운다.
Membrane이 잠길정도로 buffer를 넣고 50 °C 에서 30 min 정도 반응시킨다. (10 min 정도마다 한 번씩 흔들어 주는 것이 좋다.)
흐르는 수돗물에 1~2 min 정도 헹궈준 뒤 TBST로 10 min 간 washing한다. (혹은 TBST만을 이용하여 ß-mercaptoethanol 냄새가 나지 않을 때까지 washing한다)
다시 blocking 한 후 항체를 반응시킨다.

8. Harsh Stripping buffer 원리

Harsh stripping buffer는 강한 detergent 인 SDS가 항체의 결합을 방해하며 ß-mercaptoethanol이 항체의 이황화 결합 (disulfied bond)을 끊어 놓아 2차 구조를 제대로 유지하지 못해 항체가 더 이상 기능할 수 없는 형태로 바꾸어준다.

7. Stripping 시 주의사항

절대로 membrane 이 마르지 않도록 한다. Membrane이 마르게 되면 항체가 membrane에 강하게 결합되어 stripping이 매우 어렵다.
충분히 wahsing 해야 한다. Stripping buffer가 membrane에 남아있게 되면 새롭게 넣어준 항체가 반응 할 수 없어 좋은 결과를 얻지 못한다.
항체가 제거 되었는지 확인해야 한다. Stripping 수행 후 ECL 등을 이용하여 다시 한번 detection 해 보아야 한다. 만약 아직도 signal이 detection 된다면 반응시간을 늘리거나 더 강한 stripping buffer를 이용하여 제거한다.
다시 blocking 하는 것이 좋다. Stripping 은 blocking 단백질들 까지 모두 벗겨내기 때문에 다시 blocking하는 것이 좋다.