Revers transriptation – PCR / Quantitative real time – PCR (qPCR) / Reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) 원리 및 비교

1. RT-PCR vs qPCR vs RT-qPCR

논문이나 실험을 하다 보면 혼동되는 용어들이 종종 있다. 오늘은 그 중에 PCR에 관련된 용어를 정리해 보고자 한다. 유전자의 발현을 확인할 때 주로 사용하는 실험으로 RT-qPCR 이라는 것이 많이 사용된다 (관련 포스팅: 유전자의 발현 정의 및 개념).

이는 세포 내에 mRNA를 template로 하여 cDNA를 먼저 합성하고 합성된 cDNA를 다시 template로 하여 유전자의 발현 정도를 측정하는 실험이다. 즉, Reverse transcription 과 q-PCR이라는 두 가지의 실험이 연속적으로 수행된 실험이 RT-qPCR인 것이다. 이에 대한 개념을 확실하게 잡고 가자.

2. Reverse transcription – PCR (RT-PCR)

Reverse transcription PCR (RT-PCR)이라는 용어가 혼동되는 것은 real time PCR (RT-PCR)과 약어로 표시하는 것이 똑같기 때문이다. 그래서 반드시 full name을 확인 해야한다. 이런 혼란스러움을 방지하고자 최근에는 real time PCR 보다는 Quantitative real time PCR (q-PCR)로 많이 사용한다.

Reverse transcription PCR은 mRNA의 Poly A tail을 이용하여 Oligo dT를 primer로 사용하고 reverse transcriptase를 이용하여 cDNA를 합성한다 (Figure A). 그렇게 합성된 cDNA를 template로 하여 PCR을 수행하는 것을 RT-PCR이라고 한다. 여기서 주목해야 하는 것은 일반적인 PCR이라는 것이다. quantitative PCR (q-PCR)을 수행하는 것이 아니다. 즉, 정리하면 reverse transcription과 일반 PCR을 연속적으로 수행하는 것을 RT-PCR 이라고 한다. (Reveers transcription + PCR)

3. Quantitative real time PCR (q-PCR)

Quantitative real time PCR 혹은 quantitative PCR 이라고 하는 q-PCR은 PCR 실험 방법의 일종이다. 기본적인 원리는 polymerase chain reaction (PCR)과 동일하다. DNA를 template로 하여 해당 부분을 primer와 polymerase를 이용하여 증폭시키는 실험 방법이다.

기본적인 PCR과 다른 점을 꼽자면 PCR product를 확인하는 방법이 다르다는 것이다. 기본적인 PCR은 agarose gel에 영동하여 PCR product를 확인하지만, q-PCR의 경우에는 SYBR 와 같은 fluorescence dye를 이용하여 확인 한다는 것이다. SYBR과 같은 dye는 합성되는 이중나선 사이에 끼어 들어갈 수 있으며 이렇게 binding 한 dye의 fluorescence는 증가하게 된다. 이 fluorescence를 detector가 검출하여 얼마나 증폭 되었는지 확인 할 수 있다. 그렇다면 왜 agarose gel을 사용하는 기본적인 PCR을 사용하지 않고 q-PCR을 사용하게 된 것일까?

Agarose gel을 통한 detection은 일정 cycle 이상 PCR을 수행하게 되면 모두 saturation 되어 band의 두깨로는 양을 비교할 수 없기 때문이다. 예를 들어보자. A의 샘플에는 증폭할 수 있는 DNA가 10 가닥 있었고 B sample에는 50 가닥이 있다고 해보자. 두 샘플을 이용하여 PCR을 돌리고 10 cycle을 돌린 결과를 확인 했을 때는 B 샘플의 결과가 많은 것처럼 보인다는 것이다. 하지만 이를 40~50 cycle을 돌렸을 때는 agarose gel에서는 비슷한 두께의 band로 보인 다는 것이다. 왜냐하면 두 샘플 모두 agarose gel에서 Etbr 염색으로 보여 줄 수 있는 최대한의 양을 초월했기 때문이다. 그래서 양이 같은 것처럼 보이는 것이다.

기본적인 PCR을 통해서 양을 비교할 때 이런 오류들이 발견되었을 뿐 아니라 detection 할 수 있는 기술의 발달로 인해서 q-PCR 방법이 고안되었다. q-PCR은 일정 빛의 세기를 기준으로 몇 사이클이 돌아갔을 때 그 기준의 빛에 도달하는지 측정한다. 그렇게 때문에 초기의 template의 양이 많은 것은 적은 사이클 수에서 이미 일정 기준의 fluorescence 값을 통과하게 된다. 반대로 초기의 template의 양이 적은 것은 더 많은 사이클이 돌아가야 일정 기준의 fluorescence 값에 도달한다. 그래서 최초의 template의 양이 얼마나 있던 역치 값을 통과하는 사이클 수를 측정하여 나타내므로 saturation될 염려가 없다. 그래서 기본적인 PCR보다 양적인 변화를 비교할 때 훨씬 더 정확하다.

q-PCR에 이용되는 dye는 크게 SYBR과 Taq-man 이 있다. 이는 다음 포스팅에서 더 자세히 다뤄보도록 하겠다.

일반적인 PCR과 그 원리와 과정은 동일.

차이점이 있다면 PCR product의 확인 방법이 다르다. SYBR과 같은 fluorescence dye를 이용하여 값을 측정한다.

4. Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR)

Reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR)은 우리가 논문을 읽다 보면 많이 등장하는 실험 기법이다. 주로 유전자의 발현 양을 비교할 때 사용되는 실험 기법이다. 유전자의 발현을 비교하기 위해서는 mRNA의 양이 매우 중요하며 우리는 이 mRNA를 reverse transcription을 통해서 cDNA로 합성 할 수 있다. mRNA는 DNA에 비해서 상대적으로 불안정하기 때문에 cDNA로 합성을 먼저하고 이를 template로 q-PCR을 수행하여 그 발현양을 비교할 수 있다.

최초에 mRNA의 양이 많다면 cDNA의 합성도 많이 되었을 것이고 이를 template로 q-PCR을 수행하게 되면 상대적으로 적은 사이클에서 일정 기준의 fluorescence 값에 도달 할 수 있을 것이다. 그래서 이를 측정하여 유전자의 발현양을 비교하게 된다.

물론 cDNA를 합성하는데 사용된 RNA의 양에 따라서 template로 사용되는 cDNA의 양이 달라 질 수 있다. 그래서 이를 보정하기 위해서 house keeping gene을 이용한다. house keeping gene이란 항상 일정하게 발현되는 유전자를 말한다. 그래서 이 house keeping gene의 발현 양으로 normalization 하여 값을 보정한다. 즉, cDNA를 합성하는데 사용된 total RNA의 양이 달라서 생기는 오류를 house keeping gene읠 일정한 발현량으로 보정해 준다고 생각하면 된다.

Western blot을 수행할 때 동일양의 단백질을 사용했다는 증거로 house keeping gene인 actin의 단백질 양을 맞추고 비교하는 것처럼 q-PCR을 수행할 때도 반드시 house keeping gene을 통해서 값을 보정해 줘야 한다.

결론적으로 RT-qPCR은 앞서 설명한 두 개의 실험은 연속적으로 수행하는 것이다. Reverse transcription을 통해서 mRNA에서 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 template로 q-PCR을 수행한 것이 RT-qPCR이 되겠다.

1. Reverse transcription을 통해서 mRNA를 cDNA로 합성 (reverse transcription)

2. 합성된 cDNA를 template로 q-PCR 수행 (q-PCR)