Pull down assay protocol / Pull down assay 프로토콜 / GST-pull down assay protocol / GST-pull down assay 프로토콜
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Pull down assay 프로토콜은 크게 두 가지 방법으로 나뉘나 순서에만 약간 차이가 있을 뿐 크게 다르지 않다.
- 정제된 단백질과 bead를 먼저 붙이는 방법
- 정제된 단백질과 다른 단백질과 반응시켜 단백질 복합체를 먼저 만드는 방법 두 가지 이다.
필자는 bead를 먼저 붙이기 보다는 두 번째 방법을 선호하는 편이므로 두 번째 방법으로 서술하도록 하겠다. 첫 번째 실험 방법은 아래 그림을 참조하면 된다.
Pull down assay 프로토콜
1. 정제 단백질과 lysate의 준비
A) Bait로 사용될 단백질, 즉, 내가 interaction을 확인하고자 하는 단백질을 tagging protein이 fusion된 상태로 정제하여 준비한다.
B) Bait 단백질과 cell lysate를 준비한다. 이때 cell lysate는 과량의 detergent가 (ex SDS, SDC) 들어간 buffer는 피하는 것이 좋다. 왜냐하면 강한 detergent들이 interaction을 방해할 가능성이 있기 때문이다. 약한 detergent buffer를 사용한 후에 sonication 하는 방법을 이용하여 cell lysate를 준비하는 것이 좋다.
만약 부득이하게 RIPA buffer와 같은 강한 detergent buffer를 사용할 경우에는 최대한 적은 양을 넣어 cell을 lysis하는 것이 좋으며, 단백질의 결합을 위한 반응을 시킬 때 TNT reaction buffer를 많이 넣어주어 detergent를 많이 희석시켜 주는 것이 좋다.
2. 정제된 단백질과 lysate의 반응
정제된 단백질과 interaction 하는 단백질을 확인하기 위해서 정제 단백질과 lysate를 섞어 4 ℃ 에서 overnight 동안 반응 시킨다. 이때 pull down binding buffer 로 사용되는 TNT reaction buffer을 넣어 1ml까지 맞추어 준다. 만약 강한 detergent buffer를 사용했을 경우에는 volume을 늘려주는 것도 하나의 방법이다. 단, inteaction을 비교하는 실험에서는 tube간의 buffer의 농도가 달라지지 않도록 주의한다.
3. 단백질 복합체와 bead의 반응
Overnight 동안 반응 시켜 단백질 복합체가 형성된 tube에 bait 단백질에 fusion 되어 있는 tagging 단백질과 interaction 하는 bead를 넣어준다. 반응 시간과 조건은 제조사에서 제시하는 프로토콜을 따르는 것이 좋다. 보통 4 ℃ 에서 1~3 h 가량 반응 시킨다.
4. Washing
Bead와의 반응도 끝나게 되면 centrifugation 하여 bead를 pull down 한다. Magnetic bead의 경우에는 전자석을 이용하여 pull down 시킨다. 이때 centrifugation 할 때는 너무 강하게 하지 않는다. Bead가 깨질 우려가 있기 때문이다. 이 역시 제조사의 프로토콜을 따르는 것이 좋으나 보통 500 ~ 1000 x g, 5 min정도를 이용한다.
상층액을 제거 한 뒤 TNT washing buffer를 넣고 5 min 동안 aggitation 한다. 위 과정을 3~5회 반복한다.
5. Western blot
Interaction을 확인하기 위해서 여기서 elution을 하여 western blot을 하는 경우가 있는데 사실상 그럴 필요가 없다. Western blot 을 할 때 sample buffer를 넣고 끓여주게 되는데 이때 단백질들의 대부분의 binding이 끊어지게 된다.
그리고 bead를 포함한 모든 것을 전기 영동 해주어도 관계없다. Bead는 전하를 띄지 않을 뿐더러 혹시 전하가 있다고 하더라도 SDS-PAGE을 통과하지 못하고 well 남아 있게 된다. 하지만 서로 결합이 떨어진 단백질들은 전기 영동되어 size별로 분리 되기 때문이다.
필자의 경험상 elution을 하여 yield를 떨어뜨리기 보다는 통째로 전기 영동 하는 것이 결과가 더 좋다. 하지만 pull-down assay 후에 western blot이 아닌 다른 실험을 할 예정이라면 방금 언급한 방법은 사용할 수 없다.
6. Trouble shooting
Non-specific band가 너무 많을 때
- Pre-clearing : Cell lysate와 bait 단백질을 반응시키기 전에 bead와 lysate를 먼저 반응 시켜 bead와 interaction이 일어나는 단백질들을 제거해 본다.
- Washing buffer의 조절 : Wasing buffer의 sodium 농도와 Triton X-100의 농도를 조절해 본다.
- Bait 단백질을 정제할 때 최대한 순수하게 정제해본다.