GST-pull down assay 원리 / pull down assay 원리

Pull down assay는 실험의 이름 그대로 “Pull down” “끌어당겨서” 단백질의 interaction을 확인하는 것이다. IP와 굉장히 유사한 부분이 있다. 하지만 기본 원리에 있어서 큰 차이가 있다.

1. GST-Pull down 원리 및 workflow

Pull down assay는 tag이 달려있는 정제 단백질을 이용하여 단백질을 pull down 즉, 끌어 당기는데 이용한다. 즉, Glutathione S-Transferase (GST), His-tag, Biotin 등이 tagging 되어있는 단백질을 정제한 후에 다른 단백질 혹은 cell lystae등과 반응 시킨다. 그 후에 pull down을 하기 위해서 bead를 이용하는데 IP에서 A/G agarose bead를 이용했다면 pull down에서는 각 tagging protein에 맞는 bead를 사용한다.

• GST – Glutathione Agarose Bead
• His – Nikel bead
• Biotin – Streptavidin bead

최근에는 Magnetic bead 라고 해서 centrifugation 하는 것이 아니라 자석의 힘으로 bead를 pull down 할 수 있는 bead들도 많이 사용된다.

2. GST-pull down을 수행하기 위한 선결 조건

Pull down assay를 수행하기 위해서는 반드시 하나 이상의 단백질을 tagging protein 형태로 정제해야 한다는 것이다. Tagging protein에 결합할 수 있는 bead를 이용하여 pull down할 것이기 때문이다. 반드시 하나 이상의 단백질은 tagging 단백질 있도록 정제되어야 한다.

3. GST-pull down protocol (요약)

1. Tagging 단백질이 fusion 되어 있는 형태로 정제한다.
2. 정제된 단백질과 interaction을 확인 할 단백질 혹은 cell lysate를 buffer와 함께 섞어준 후 단백질이 결합할 수 있도록 충분히 반응시킨다.
3. 반응이 끝난 단백질 복합체가 들어있는 튜브에 Bead를 넣고 반응시킨다.
4. 반응이 끝난 tube를 원심 분리하여 bead+단백질복합체를 pull-down시킨다.
5. 비특이적인 반응을 제거하기 위해서 washing buffer로 washing한다.
6. Western blot을 수행하여 단백질의 결합을 확인한다.

4. Pull down assay vs Immunopreicipitation

기본적으로 Bait 단백질을 침강시켜서 interaction하고 있는 단백질들을 동정한다는 실험 목적은 같다. 또한, 마지막에 interaction을 확인하는 방법까지도 western blot과 동일하다. 하지만 단백질을 인지하는 방법과 bead의 종류가 다르며, pull-down assay의 경우에는 반드시 하나 이상의 단백질에 tagging 단백질이 fusion되어 있어야 한다.

5. Pull-down assay 연관 포스팅

Pull-down assay buffer

Pull down asssay protocol