Immunoprecipitation (IP) buffer / 면역침강법 buffer / EDTA 역할 / EGTA 역할
By 어떤 buffer가 가장 적합한지 정하는 것에는 정답은 없다. 각 protein의 특성이 다르기 때문에 그 특성에 맞게 사용을 하는 것이 가장 좋다. Detergent의 경우로 예를 들자면 너무 강한 detergent가 포함되어 있는 경우에는 target의 protein-protein interaction 마저 깰 수 있지만 너무 약한 detergent는 non-specific binding을 제거 할 수 없어 자칫 잘못된 결과를 얻을 수도 있다. 여러 방면으로 실험해보고 사용할 것을 추천한다.
Lysis buffers
IP를 수행할 때 가장 적합한 lysis buffer는 protein의 denaturation을 최소화하는 것이다. 주로 non-ionic detergent를 사용한다 (NP-40 , Triton X-100). SDS계열의 detergent는 강한 detergent 로 protein-protein interaction에도 영향을 줄 수 있기 때문이다. 또한, sodium의 농도 역시 protein-protein interaction에 영향을 줄 수 있기 때문에 protein의 특성에 맞게 조절해야 좀 더 좋은 결과를 얻을 수 있다.
- Soduim concetration: 0–-1 M
- Detergent, non-ionic: 0.1–2%
- Detergent, ionic: 0.01–0.5%
- Divalent cations: 0–10 mM
- EDTA: 0–5 mM
- pH: 6–9
EDTA의 역할 (EDTA in immunoprecipitation buffer)
EDTA 는 chelating agent로 많이 사용된다. IP buffer 에서 EDTA의 역할은 protein이 degradation되는 것을 막는 것이다. EDTA는 2가 양이온을 제거하는 목적으로 사용된다. 단백질을 분해하는 protease가 역할을 수행하기 위해서는 2가 양이온들이 필요하다. 그러므로, EDTA는 protease들이 제 역할을 할 수 없도록 2가 양이온을 제거하는 chelating agent로 사용되는 것이다.
Non-denaturing lysis buffer
단백질을 denature 시키지 않고 cell을 lysis할 수 있는 buffer이다. 6개월 정도 보관이 가능하며 사용 직전에 protease를 넣어준다 (protease의 half-life는 매우 짧다).
- 20 mM Tris HCl pH 8
- 137 mM NaCl
- 1% Nonidet P-40 (NP-40 or Triton X-100)
- 2 mM EDTA
Detergent-free soluble protein lysis buffer
어떤 protein들은 detergent에 민감하여 아예 사용하지 못하는 경우도 있다. 이럴 경우에는 detergent가 없는 buffer를 사용하고 sonication 혹은 homogenizer를 통해서 물리적인 방법으로 cell 을 lysis해준다. 역시 6개월정도 보관이 가능하며 사용 직전에 protease를 넣어준다.
- PBS
- 5 mM EDTA
- 0.02% sodium azide
Wash buffers
washing 할때 사용하는 buffer이다. Non-specific band가 많을 경우에는 sodium 농도와 Triton X-100의 농도를 조절 할 수 있다. 다만, 고농도로 washing을 할 경우에는 target protein의 결합도 깨질 수 있으니 주의하자. 4°C 에서 6개월 보관 가능하며 사용직전에 protease inhibitor를 넣어준다.
- 10mM Tris; adjust to pH 7.4
- 1mM EDTA
- 1mM EGTA; pH 8.0
- 150mM NaCl
- 1% Triton X-100
- 0.2mM sodium orthovanadate
- Protease inhibitor cocktail
EGTA의 역할 (EGTA in immunoprecipitation buffer)
EGTA도 EDTA와 마찬가지로 protease들이 제 역할을 할 수 없도록 2가 양이온을 제거하는 chelating agent로 사용된다.