Immunoprecipitation 원리 / Immunoprecipitation principle / IP 원리 / IP principle / 면역침강법 원리
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Immunoprecipitation 원리인 항원 항체 반응을 이용하여
단백질 간의 상호 결합을 (protein-protein interaction)
확인하는 실험 방법이다.
각 단백질들의 결합은 생명 활동을 조절하는데 있어서 아주 중요한 역할을 담당한다.단백질 간의 결합을 찾아내고 확인하는 것은 생체 내 여러 기작을 조절하는 메커니즘을 밝혀내는데 매우 중요하다. 이번 포스팅에서는 immunoprecipitation 원리와 workflow, 수행 하기 위한 선결 조건, IP assay의 응용 등을 다룰 것이다.
1. Immunoprecipitation 원리 및 workflow
1. 항체와 단백질의 결합
2. 항체-단백질 복합체와 A/G agarose bead와의 결합
3. Centrifugation 후 Washing을 통한 비 특이적인 결합 제거
4. Western blot
Immunoprecipitation 원리는 항원 항체 반응이다. “immuno” 라는 이름에서 알 수 있듯이 immune 작용을 담당하는 항체를 사용하며, 이 항체-단백질을 복합체를 A/G agarose bead를 사용하여 “precipitation” (침전) 시킨 후 western blot을 통해서 확인한다.
따라서, immunoprecipitation 원리인 항원-항체 반응을 이용하여 antibody와 target protein간의 결합을 유도한 뒤, precipitation (침전) 하기 위해서는 antibody-protein complex가 충분한 무게를 갖게 해야 한다. 이 역할을 하는 것이 A/G agarose bead이다.
여기서 A/G는 protein A와 protein G를 뜻한다. Protein A/G는 원래 bacteria의 단백질로 Protein A는 Staphylococcus aureus (황색 포도상 구균)에서 발견되었고 Protein G는 Streptococcus 에서 발견되었다. 이 단백질들은 모두 bacteria의 surface protein이며 항체를 구성하는 IgG (immunoglobulin G) binding domain을 다수 가지고 있어 IgG와 강하게 결합하는 단백질이다. Protein G는 albumin에도 강력하게 결합하나 immunoprecipitation 에서는 방해되므로 Protein G의 albumin binding domain은 제거한 후 사용한다.
즉, 항체와 결합된 단백질을 침전시키기 위해서 bead에 protein A/G가 코팅 되어 있는 것이다. 이것은 antibody의 IgG 부분과 강력히 결합할 수 있게 하여 유리 구슬이 precipitation을 할 수 있는 충분한 무게로써 작용한다. Centrifuge를 통해서 bead와 단백질 복합체를 모은 뒤 washing 과정을 거친 후에 western blot을 통해서 두 단백질간의 interaction을 확인하면 된다.
2. Immunoprecipitation을 수행하기 위한 선결 조건
- 단백질 간의 상호작용을 알아볼 단백질 선정. -> ex) p53 와 p300의 결합유무
- 사용할 antibody의 선택 -> ex) IP antibody : p53 / Western blot antibody : p300
앞에서 알 수 있듯이 immunoprecipitation 원리인 항원 항체 반응을 이용하여 두 단백질의 결합을 확인하는 실험이므로 반드시 target 단백질을 두 개 이상 선정해야 한다. 또한, immunoprecipitation 원리가 항원 항체 반응이므로 당연히 사용할 antibody역시 보유하고 있어야 한다. 만약에 내가 관심 있는 단백질과 interaction하는 다수의 protein을 동정하고 싶은 경우에는 Immunoprecipitation 후에 mass spectrometry analysis를 (질량분석법) 수행하여 interaction partner들을 동정할 수 있다.
3. Immunoprecipitation 프로토콜 (요약)
1. Tissue/Cell을 lysis하여 cell lysate를 얻는다.
2. 1~2ug의 cell lysate를 antibody와 반응시킨다. (4도, overnight)
3. Agarose bead와 antibody를 반응시킨다. (4도, 1 ~ 2h)
4. IP buffer를 사용하여 2~3 회 washing 한다 (agitation on rotator, 5~10 min)
5. Western blotting 한다.
4. Immunoprecipitation 응용
실제 논문에서 immunoprecipitation은 다양하게 그리고 많이 사용된다. 주로 단백질 간의 결합을 확인하는데 쓰이지만 그 외에도 다른 목적으로 사용된다. 예를 들어, 단백질의 번역 후 수식화 (post-translational modification)을 확인하는데 사용되기도 하며, 이를 기반으로 하는 다른 여러 실험 방법도 존재한다.
– Chromatin immunoprecipitation (ChIP assay)
– ChIP-sequencing
– ChIP on Chip
– Immunoprecipitation and mass spectrometry analysis