GST pull-down assay buffer / GST pull-down assay 버퍼 / GST pull-down assay binding buffer / GST pull-down 버퍼
By GST pull-down을 수행할 때 cell lysate와 GST가 tagging 된 protein을 섞어 주고 반응 이 잘 일어날 수 있는 환경을 조성하는 buffer를 넣어준 뒤 단백질들의 결합이 일어날 수 있도록 incubation 시켜준다.
이때 사용하는 buffer는 여러 종류가 있겠지만 가장 기본적인 buffer의 조성을 적도록 하겠다.
GST-pull down binding buffer
Tris-HCL, NaCl, Triton X-100 (TNT) reaction buffer
보통 TNT buffer는 washing 목적으로 Tris-HCL, NaCl, Tween 20으로 많이 사용한다. 여기서 사용되는 TNT buffer라는 이름은 같다.
하지만 Tween-20 이 아니라 Triton X-100 이 사용되며 그 목적도 washing이 아니라 단백질간의 결합이다. 조성은 다음과 같다.
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.6
- 150 mM NaCl
- 0.1% Triton X-100
이 buffer는 GST tagging이 되어 있는 protein과 cell lysate를 섞어줄 때 사용 하는 buffer이다. 보통 cell을 lysis 할 때 많은 detergent가 들어가게 된다.
이 detergent들이 단백질간의 결합을 방해하는 요소로 작용할 수 있으므로 이를 희석하여 binding에 좋은 환경으로 만들어 주기 위해서 사용한다.
다만 서로 다른 lysate를 사용할 경우에 양을 잘 맞추어 같은 농도에서 반응이 일어나도록 해야한다.
GST-pull down washing buffer
Tris-HCL, NaCl, Triton X-100 (TNT) washing buffer
이 buffer는 정제 단백질과 cell lysate에 들어있는 단백질간의 결합이 이루어지 GST-bead를 이용하여 pull down이 끝난 상황에서 사용된다.
모든 결합이 완료된 후에 비특이적인 결합 (non-specific binding)을 제거할 목적으로 사용된다. 그렇기 때문에 sodium 농도와 Triton X-100의 농도를 binding buffer에 비해 높여서 사용한다. 조성은 다음과 같다.
- 50 mM Tris-HCl, pH 7.6
- 300 mM NaCl
- 0.5% Triton X-100
만약에 non-specific 한 결합이 너무 많을 경우에는 sodium농도와 Triton X-100의 농도를 조절해 볼 수 있다. 하지만 농도를 너무 높일 경우에는 원래 결합해야 할 단백질의 결합마저도 끊어질 수 있으므로 주의한다.