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1. Genome editing의 기본 원리

유전자 편집의 (Genome editing) 기본 원리는 거의 동일하다.특정 부위를 인지하는 domain과 DNA를 절단하는 domain 크게 두 가지로 나뉘어져 있으며, 이것을 어떠한 것으로 사용 하는 가에 따라서 그 실험 방법이 달라진다고 생각하면 된다.

2. 크리스퍼 유전자 가위 원리 (CRISPR/Cas9 원리)

크리스퍼 유전자 가위 (CRISPR/Cas9 system)는 어디서 갑자기 발명된 기술이 아니다. 크리스퍼 유전자 가위 원리는 사실 박테리아의 immunsystem이다. 박테리아도 외부에서 침입하는 바이러스를 막기 위한 immune system이 존재한다.

바이러스는 반복되는 특정 sequence를 가지고 있고 박테리아는 이를 이용하여 바이러스를 제거한다. 이 반복되는 특정 서열을  Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) 라고 한다.

Cas9은 endonuclease 이다. 특정 염기서열을 인지하여 DNA를 자르는 효소이다. 크리스퍼 유전자 가위 (CRISPR/Cas9) 에서는 바로 Cas9 효소가 가위의 역할이다.

박테리아는 CRISPR라고 하는 sequence에서 나온 gRNA가 빠르게 바이러스의 genome을 인지하고 상보적으로 결합한다. Cas9은 gRNA에 붙고  protospacer adjacent motif (PAM) 라는 3개의 nucleotide가 일치하면 그 DNA를 잘라 버린다.

CRISPR/Cas9 system은 박테리아의 immune system을 활용하여 우리의 실험에 적용한 것이다.

3. 크리스퍼 유전자 가위 활용 #1 (유전자의 knock-out)

 우리는 실험실에서 어떻게 크리스퍼 유전자 가위를 활용하고 있을까?

우리는 Cas9 protein과 gRNA를 동시에 세포내에 동시에 발현 시켜 줄 수 있다. gRNA는 우리가 knock out 시킬 gene과 상보적인 서열을 가지고 있게 디자인한다. 그렇기 때문에 세포 내에서 발현된 gRNA는 해당 seqeunce와 상보적인 seqeunce에 결합하게 될 것이다. 그리고 gRNA에 binding 하는 Cas9 효소 역시 그 부분에만 specific하게 binding 할 것이다.

그 후에 Cas9이 DNA를 잘라 double strand break를 일으킨다. DNA가 잘렸다고 해서 세포는 가만히 있지 않는다. 이를 수리하려는 DNA repair 기작이 가동된다. 이때, Non-homologous end joining (NHEJ) 혹은 Homology directed repair (HDR) pathway가 작동한다. 이 DNA repair에 관한 내용은 다음에 자세히 포스팅 하도록 하겠다. 간단히 요약하면 NHEJ는 빠르고 간편하지만 error가 많은 수리 방법이고 HDR은 효율은 떨어지지만 정확하게 수리하는 방법이다.

CRISPR/Cas9 실험은 NHEJ pathway를 이용한 것이다. NHEJ repair는 수리 중 random하게 sequence가 insertion 되거나 deletion 된다. 이를 indel 이라 한다. 즉, indel이 발생하면 frame shift가 발생하고 뒤쪽 어딘가에 stop codon이 형성되면 단백질이 제대로 만들어지지 않는다. 즉, knock out 되는 것이다.

여기서 의문이 들 수 있다. indel이 3의 배수로 생성되면 frame shift가 발생할 수 없지 않나? 그렇다. knock out이 아니라 몇 개의 아미노산이 추가 혹은 없어지게 된다. 그렇기 때문에 knock out을 위해서는 제대로 stop codon이 형성되어 유전자가 발현이 없는cell 들만 골라서 사용한다.

4. 크리스퍼 유전자 가위 활용 #2 (유전자의 발현 조절)

CRISPR/Cas9 system을 활용한 다른 실험으로는 CRISRPi 와 CRISRa가 있다.

 CRISPRi (CRISPR inhibition) 와 CRISPRa (CRISRP activation)는 dCas9 (Dead Cas9)을 이용한 것이다. 여기서 dCas9은 Cas9의 catalytic activity가 없는 것을 말한다. CRISPRi (CRISPR inhibition)는 말 그대로 CRISPR/Cas9 을 이용하여 유전자 발현을 억제하는 실험 방법이다. Cas9을 endonuclease 로 사용하는 것이 아니라 gRNA와 결합하여 특정 부분으로 repressor나 activator를 데리고 갈 수 있는 중간 역할자로 사용한 것이다.

우리가 발현을 억제하고 싶은 유전자의 promoter부위에 결합할 수 있는 gRNA를 발현 시켜 주고 repressor (ex KRAB)와 fusion된 dCas9을 발현 시켜 주었다고 생각해보자. gRNA는 promoter 부위에 결합할 것이고 여기에 dCas9 단백질이 따라서 결합할 것이다. dCas9 단백질과 KRAB은 fusion되어 있으므로 결론적으로 repressor가 promoter 부위에 결합한 것이다. 즉 유전자 발현은 억제된다.

 CRISPRa는 repressor가 아니라 VP64와 같은 activator를 fusion 해 주었다고 생각하면 된다. 그렇다면 promoter부위로 activator가 오게되어 유전자 발현은 촉진된다. 이를 응용하여 최근에는 특정 유전자 부위의 histone modification만 조절하는 실험 기법도 사용되고 있다. p300 같은 Histone acetyltransferase를 fusion하여 특정 promoter 부위의 histone marker를 조절할 수도 있다.