ChIP assay 원리 / Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay 원리 / ChIP assay 목적

1. ChIP assay 목적 및 개요

ChIP assay의 목적은 단백질이 DNA와 결합하는지 확인하는 것이다. 단백질과 그 단백질이 결합한 DNA를 화학적으로 연결 시킨 뒤 단백질을 인지하는 항체를 이용하여 immunoprecipitation 한다. 이때 같이 딸려 나오는 DNA 들을 정제한 뒤 확인하고자 하는 DNA 서열 부위의 primer를 통해서 PCR을 수행하여 확인하는 실험이다.

2. ChIP assay의 원리

ChIP assay는 (Chromatin immunoprecipitation assay) 기본적으로 IP 실험을 기반으로 한다. 사실상 IP assay를 응용한 실험 방법이라고 하는 것이 맞겠다. 기본원리는 IP와 마찬가지로 항원-항체 반응이다. 항체가 단백질을 특이적으로 인지하고 A/G agarose bead에 강하게 결합하는 것을 기본으로 한다.

3. ChIP assay VS IP assay

IP assay가 단백질과 단백질의 결합을 확인하고자 했다면 ChIP assay의 목적은 단백질과 DNA간의 결합을 확인하고자 한다. 기본적인 실험원리는 같다 (IP 원리 참고).

단백질을 특이적으로 인지하는 항체를 넣어주고 반응 시킨 뒤에 A/G agarose를 넣어 항체와 bead간의 복합체를 형성한다. Bead는 침강 (immunoprecipitation)을 하기 위해 무게를 주기 위한 것으로 원심 분리가 가능하게 한다. 이때 단백질과 결합해 나온 DNA를 정제하여 PCR을 수행하여 단백질과의 결합을 확인한다.

단, DNA는 단백질과 달리 이중나선으로 쭉 연결되어 있는 형태이다. 따라서 그냥 immunopreiciptiaton을 할 경우에 결국 모든 DNA가 한꺼번에 끌려 나오게 된다. 그렇기 때문에 단백질이 결합된 부위만 끌려 나오게 하기 위해서 DNA를 200bp 정도의 작은 크기로 쪼개주는 sonication step이 필요한 것이다.

Sonication은 음파를 이용하여 DNA나 단백질등을 잘게 쪼개는 실험 기법이다. 하지만 sonication을 수행하면 DNA와 단백질의 결합 마저 모두 깨질 우려가 있다. 그래서 단백질과 결합되어 있는 DNA를 공유 결합시켜 굉장히 안정하게 하는 것을 cross linking 이라고 하며 ChIP assay에서 반드시 필요한 step이다.

4. ChIP assay 선결조건

ChIP assay를 수행하기 위해서 반드시 필요한 것이 있다. IP를 수행할 항체와 PCR을 수행하기 위한 primer이다. 즉, 기본적인 target이 필요하다는 것이다. IP를 수행할 단백질이 정해져야 항체를 사용할 수 있으며, primer를 디자인하기 위해서는 해당 DNA 부위가 정해져야 한다. 즉, 결합을 확인하고자 하는 단백질과 DNA 부위가 정해져야 실험수행이 가능하다.

최근에 seqeuncing 기술의 발달로 단백질이 결합한 DNA 전부를 seqeuncing 할 수 있게 되었다. 이를 ChIP seqeuncing (ChIP-seq)이라고 한다. ChIP-seq은 해당 단백질이 붙은 DNA 전부의 서열을 분석할 수 있으므로 genome wide한 결과를 얻을 수 있으며 단백질의 binding motif, 타겟 유전자 등 다양한 결과를 얻을 수 있다.

5. ChIP assay workflow

1. DNA와 단백질의 결합을 화학적으로 고정하는 cross-linking 과정을 수행한다. 주로 formaldehyde를 이용하여 cross link 한다. Cross link란 DNA-DNA 혹은 단백질-단백질, 단백질 -DNA의 결합에 공유 결합이 일어나 굉장히 안정해지는 것을 뜻한다.
2. Sonication을 수행하여 DNA를 200 bp 정도로 잘게 쪼개준다. 이때 DNA-단백질 복합체는 공유 결합으로 연결되어 떨어지지 않는다.
3. IP를 수행하여 관심있는 단백질과 DNA 복합체를 분리한 뒤 나머지는 버린다.
4. Reverse cross linking 과정을 수행하여 공유결합으로 연결되어 있던 DNA-단백질 복합체를 분리하고 DNA 만을 정제한다.
5. DNA를 주형으로 미리 디자인 해 놓은 primer를 이용하여 PCR을 수행한다.

연관포스팅

ChIP assay buffer

ChIP assay protocol

IP assay 원리